2017年11月27日

 

附件1

保健食品产品说明书

食健备G201746000156

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成长快乐牌多种维生素钙咀嚼片

附件2

保健食品产品技术要求

食健备G201746000156

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成长快乐牌多种维生素钙咀嚼片

【原料】碳酸钙,β-胡萝卜素,醋酸视黄酯,维生素D3,盐酸硫胺素,核黄素,盐酸吡哆醇,氰钴胺,叶酸,L-抗坏血酸钠,D-泛酸钙,D-α-醋酸生育酚

【辅料】乳粉,山梨糖醇,白砂糖,可可粉,羟丙基甲基纤维素,硬脂酸镁,包衣预混剂（聚乙烯醇,滑石粉,吐温 80,聚乙二醇）

【生产工艺】本品经制粒、混合、压片、包衣、包装等主要工艺加工制成。

【直接接触产品包装材料的种类、名称及标准】

聚乙烯瓶应符合《口服固体药用高密度聚乙烯瓶》（YBB00122002）；聚乙烯封口膜应符合《复合食品包装袋卫生标准》（GB 9683）

【感官要求】应符合表1的规定。

表 1 感官要求

 

【理化指标】应符合表2的规定。

表2 理化指标

【微生物指标】应符合表3的规定。

表3 微生物指标

【功效成分或标志性成分指标】应符合表4的规定。

表4 功效成分指标

1.β-胡萝卜素的测定

本标准修改采用GB 5009.83-2016《食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定色谱条件二》的方法。

本标准与GB 5009.83-2016《食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定色谱条件二》的主要差异为修改了样品前处理试剂及标准品、样品的定容液。

1.1试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。

1） 无水硫酸钠（Na2SO4）。

2） 乙醇：分析纯。

3） 氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200ml水溶解。临用前配制。

4） 石油醚：沸程30℃～60℃。

5） 甲醇：色谱纯。

6） 乙腈：色谱纯。

7） 三氯甲烷：色谱纯。

8） 抗坏血酸：

9） 正己烷：色谱纯。

10） β-胡萝卜素标准品,经认证并授予标准物质证书的标准物质。

11）标准溶液

β-胡萝卜素标准储备液（100ug/ml）:准确称取β-胡萝卜素标准品10mg（精确到0.1mg），用正己烷定容至100ml棕色容量瓶中。

注：β-胡萝卜素标准储备液须-20℃以下避光储存，使用期限不超过3个月。标准工作液临用前配置，标准储备液用前需校正，具体操作见校正方法。

β-胡萝卜素标准工作液：分别吸取β-胡萝卜素标准储备液0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml于100ml棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、4.0ug/ml。

1.2 仪器和设备

1.2.1 高效液相色谱仪，带紫外检测器或二级管阵列检测器。

1.2.2 恒温磁力搅拌器：20℃～80℃。

1.2.3 恒温水浴锅：20℃～100℃。

1.2.4 天平：感量为0.1mg。

1.2.5 旋转蒸发器

1.2.6 高纯氮气

1.3 样液的制备

1.3.1试样预处理：称取经粉碎均匀的试样约10g（精确到0.1mg）于250ml三角瓶中，加入1.0g抗坏血酸，固体试样加入50ml45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀。

1.3.2皂化：于上述处理的试样液中加入100ml乙醇，充分混匀后加入25ml氢氧化钾水溶液混匀，放入磁力搅拌棒，充氮气排出空气，盖上胶塞。1000ml的烧杯中加入300ml的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53℃±2℃，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化45min后，取出立刻冷却到室温。（注:如皂化不完全可适当延长皂化时间至1h）

1.3.3提取：用少量的水将皂化液全部转入500ml分液漏斗中，加入100ml石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温震荡10min后静置分层，将水相转入另一500ml分液漏斗中，按上述方法进行第二次、第三次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，用100mL石油醚分三次洗涤分液漏斗及无水硫酸钠，滤液收入500ml圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）或氮吹至近干。残渣用石油醚转移至50ml容量瓶中，定容。

1.3.4稀释：精密吸取上述液1.00ml置10ml棕色容量瓶中，40℃±2℃水浴中氮气吹干用正己烷溶解并定容，混匀，经0.45um滤膜过滤后备用。

1.3.5同法处理样品加标（添加适量标准物质或标准溶液）及试剂空白。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18柱（粒径5μm，250mm ×4.6mm）或同等性能的色谱柱。

流动相：三氯甲烷—乙腈—甲醇=3+12+85，将1L的流动相中加入0.4g的抗坏血酸，经0.45um膜过滤后备用。

流速：1.5 ml/min。

检测波长：450 nm。

柱温：35℃±1℃

进样量：10uL

1.5 结果计算

β-胡萝卜素的含量计算：

C×V×F

  X =                ×100

      m×1000

式中：

X--试样中组分的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；

C--从标准曲线得到的β-胡萝卜素待测液的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)；

V--试样溶液的定容体积，单位为毫升（ml）；

F--试样稀释倍数。

m--试样的质量，单位为克（g）；

1000--换算系数(由ug/g换算成mg/g的换算因子)；

100 --换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

1.6 标准溶液校正方法

β-胡萝卜素标注储备液使用前需要进行校正，具体操作如下：

1.6.1吸取β-胡萝卜素标准储备液1.00ml，置50ml棕色容量瓶中用正己烷稀释至刻度混匀。根据给定波长于紫外-可见分光光度计测定β-胡萝卜素吸光值，以正己烷为空白。按下表给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该β-胡萝卜素的浓度。

                                   吸光值的测定条件

标准品	E(β-胡萝卜素比吸光系数)	波长λ（nm）
β-胡萝卜素	0.2620	450

 浓度计算公式

                  A            50

P =           ×                

       E            1.00 

式中：

P——β-胡萝卜素浓度，单位为微克每毫升（ug/ml）；

A——β-胡萝卜素的平均紫外吸光值；

E——β-胡萝卜素在正己烷中的比吸光系数为0.2620；

   50 

        ——标准使用液稀释倍数。

  1.00

 

 

2.维生素D的测定

本方法修改采用GB 5009.82-2016 《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定 第四法》的方法。本方法与GB 5009.82-2016第四法相比，主要差异为省略了测定样液的净化步骤。

2.1 试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。

1）无水硫酸钠。

2）乙醇：色谱纯。

3）氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200mL水溶解。

4）石油醚：沸程30℃～60℃。

5）甲醇：色谱纯。

6）维生素C的乙醇溶液（15g/L）。

7）维生素D3标准品(CAS号:511-28-4),经认证并授予标准物质证书的标准物质。

8）维生素D3标准储备液（100μg/mL）：精密称取10mg维生素D3标准品，用乙醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中,再吸取储备液1mL置于10mL棕色容量瓶中，稀释定容制成10μg/mL中间液，用于样品加标测定。

注：维生素D3标准储备液转移至100mL的棕色试剂瓶,-20℃冰箱中密封保存，使用期限不超过3个月。标准工作液临用前配制，标准储备溶液用前需校正，具体操作见校正方法。

2.2 仪器和设备

1）高效液相色谱仪，带紫外检测器或二级管阵列检测器。

2）旋转蒸发器。

3）恒温磁力搅拌器：20℃～80℃。

4）恒温水浴锅：20℃～100℃。

5）氮吹仪。

6）天平：感量为0.1mg。

2.3 试样处理

试样预处理：称取经粉碎均匀的试样约10g (精确到0.1mg)于250mL三角瓶中，加入50mL45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀。

2.4 待测液的制备

2.4.1 皂化

于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液，充分混匀后加25mL 氢氧化钾水溶液混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000mL的烧杯中加入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53℃±2℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。

2.4.2 提取

用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次、第三次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，用100mL石油醚分三次洗涤分液漏斗及无水硫酸钠，滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）或氮吹至近干。残渣用石油醚转移至50mL容量瓶中，定容。

2.4.3 稀释：精密吸取上述液5.00mL置10mL棕色容量瓶中，40℃±2℃水浴中氮气吹干，精确加入2.00mL甲醇溶解残渣，混匀，经0.45μm滤膜过滤后备用。

2.4.4同法处理样品加标（添加适量标准物质或标准溶液）及试剂空白。

2.5 色谱条件

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇:水=92:8。

流速：0.8mL/min。

检测波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：100μL。

2.6 标准曲线的绘制

1）分别吸取维生素D3标准储备0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.600μg/mL、0.800μg/mL、1.000μg/mL。

2）分别将维生素D3标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰面积。以峰面积为纵坐标，以维生素D3标准工作液浓度为橫坐标绘制维生素D3标准曲线。

2.7 维生素D3试样的测定

将试液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中维生素D3浓度，计算得出结果。

2.8 结果计算

样品中维生素D（以维生素D3计）的含量，按以下公式计算：     

             C×V×F

 X =             ×100

          m

式中：

X--试样中维生素D3的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；

C--从标线得到的维生素D3待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V--试样溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；

F--试样稀释倍数；

m--试样的质量，单位为克（g）；

100--换算系数，即单位微克每克（μg/g）转化为单位微克每百克（μg/100g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

2.9 维生素D3标准储备液校正方法

  吸取维生素D3标准储备液2.00mL，置25mL棕色容量瓶中用乙醇稀释至刻度混匀，根据给定波长于紫外-可见分光光度计测定维生素D3吸光值，以乙醇为空白。按表给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该维生素D3的浓度。

             吸光值的测定条件

标准品	(维生素D31%比色光系数)	波长λ（nm）
胆钙化醇(维生素D3)	462	264

 

浓度计算公式
                 A             25

P =           ×              ×104

       E             2.00 

式中：

P--维生素D3浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；

A--维生素D3的平均紫外吸光值；

E--维生素D31%比色光系数；

 25

       --标准储备液的稀释倍数；‍

 2.0

104 --换算系数。

 

 

3.维生素B1的测定

本方法修改采用GB 5009.84-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定第一法》的方法。本方法与GB 5009.84-2016第一法相比，主要差异为省略了样液高压处理、酶解的步骤。

3.1试剂和材料

本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

1） 正丁醇。

2） 铁氰化钾。

3） 氢氧化钠。

4） 浓盐酸。

5） 冰乙酸。

6） 甲醇：色谱纯。

7） 维生素B1标准品：盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl)),CAS:67-03-8,纯度≥99.0%。

8） 铁氰化钾溶液(20g/L)：称取2g铁氰化钾，用水溶解并定容至

100ml。临用前配制。

9） 氢氧化钠溶液(100g/L)：称取25g氢氧化钠，用水溶解并定容至250ml。

10） 碱性铁氰化钾溶液：将5ml铁氰化钾溶液与200ml氢氧化钠溶液混合。临用前配制。

11） 盐酸(0.1mol/L)：吸取9ml浓盐酸，溶于1000ml水中。

12） 盐酸(0.01mol/L)：吸取0.1mol/L盐酸50ml,用水稀释并定容至500ml。

13） 乙酸钠溶液(0.05mol/L)：称取6.80g三水乙酸钠，加900ml水溶解，用冰乙酸(调pH值值至4.5，定容至1000。经0.45um微孔滤膜过滤。

14）标准溶液

a.维生素B1标准储备液(500μg/mL):精密称取经五氧化二磷或者氧化钙干燥24h的盐酸硫胺素标准品56.1mg(精确至0.1mg)，用0.01mol/L盐酸溶解并定容于100ml。

b.维生素B1标准中间液：准确吸取2.00ml标准储备液用水稀释并定容至100ml。

c.维生素B1标准工作液：分别吸取维生素B1标准中间液0ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml，用水溶解并定容至100ml，制成标准系列浓度。

3.2仪器和设备

3.2.1 超声波振荡器

3.2.2 高效液相色谱仪，带荧光检测器。

3.2.3 天平：感量为0.1mg

3.2.4 pH 计：精度为0.01

3.2.5 料理机

3.3 试样预处理：

3.3.1取样品适量，磨成粉末，精密称取样品约1.0g（精确到0.0001g）于200ml棕色容量瓶中，加0.1mol/L HCL超声10min,并稀释至刻度，摇匀，置于4000转/分钟离心10min，滤过，取滤液即得

3.3.2样液衍生化：

分别取上述滤液10.00ml于50ml具塞比色管中，加入5ml碱性铁氰化钾，充分混匀后，加10.00ml正丁醇，强烈振荡置约3min，充分分层，取上清液经有机微孔滤膜过滤，供测试用。

3.3.3同法处理样品加标（添加适量标准物质或标准溶液）及试剂空白。

3.4色谱条件

色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5μm，250mm ×4.6mm）色谱柱。

流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液-甲醇=65+35。

流速：0.70 ml/min。

检测波长：激发波长375nm，发射波长435nm。

进样量：10μL。

3.5 标准曲线绘制

将维生素B1标准系列工作液衍生物依次按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.6 样液测定

将样液衍生物按上述色谱条件进样测定，从标准曲线中得样液中维生素B1的浓度。

3.7 结果计算

试样中维生素B1（以硫胺素计）的含量计算： 

C×V×f ×100

X =                  

        m×1000

 式中：

X ——试样中维生素B1的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；

C ——试液的进样浓度，单位为微克每毫升（ug/ml）；

V——试样定容体积，单位为毫升（ml）；

f——试样稀释倍数；

m——试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

注:试样中测定的硫胺素含量乘以换算系数1.121，即得盐酸硫胺素的含量。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

 

 

4.维生素B2的测定

本方法修改采用GB 5009.85-2016 《食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定 第一法》的方法。本方法与GB 5009.85-2016第一法相比，主要差异为省略了样液高压处理、酶解的步骤，使用二甲亚砜溶解样品，并置于85℃恒温水浴锅中振摇溶解。

4.1试剂和材料

本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1.1 三水乙酸钠。

4.1.2 冰乙酸。

4.1.3 浓盐酸。

4.1.4 甲醇：色谱纯。

4.1.5 二甲基亚砜。

4.1.6 维生素B2标准品(C17H20N4O6,CAS号:83-88-5)：纯度：≥97.0%。

4.1.7 盐酸(1+1)：量取100ml浓盐酸缓慢倒入100ml水中，摇匀。

4.1.8 乙酸钠溶液(0.05mol/L)：称取6.80g三水乙酸钠，加900ml水溶解，用冰

乙酸调pH值至4.5，用水定容至1000ml。经0.45um微孔滤膜过滤。

4.1.9 标准溶液

4.1.9.1 维生素B2标准储备液（100ug/mL）:将维生素B2标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷干燥器中干燥处理24h，称取10mg(精确至0.1mg)的维生素B2标准品，加入盐酸2ml，超声溶解后，用水定容至100ml。混匀后转移入棕色玻璃容器中,在4℃冰箱中贮存,保存期2个月。

4.1.9.2 维生素B2标准储备液的校正

准确吸取1.00mL维生素B2标准储备液至10mL棕色容量瓶中，加1.30mL 0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水稀释至刻度，作为标准测试液。准确吸取1.00mL 0.012mol/L的盐酸溶液，加1.30mL 0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水定容到10mL，作为对照溶液，用1cm比色杯于444nm波长下，以对照溶液为空白对照,测定标准校正溶液的吸收值。

维生素B2标准储备液的浓度计算

A444×104×10

P=                  

         328

式中：

 P-- 维生素B2标准储备液的质量浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)；

A444 -- 维生素B2标准测试液在444nm波长下的吸光度值；

104-- 将1%的标准溶液浓度单位换算为测定溶液浓度单位(ug/mL)的换算系数；

10 -- 标准储备液的稀释因子；

328--维生素B2在444nm波长下的百分吸光系数，即在444nm波长下，液层厚度为1cm时，浓度为1%的维生素B2溶液(盐酸-乙酸钠溶液，pH=3.0)的吸光度。

4.1.9.3 维生素B2标准中间液：准确吸取10.00ml标准储备液用水稀释并定容至100ml，此溶液中维生素B2浓度为10ug/ml。在4℃冰箱中避光贮存,保存期1个月。

4.1.9.4 维生素B2标准工作液：分别吸取维生素B2标准中间液0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml，用水溶解并定容至100ml。该标准系列浓度分别为0.00ug/ml、0.05ug/ml、0.10ug/ml、0.20ug/ml、0.50ug/ml、1.00ug/ml。

4.2 仪器和设备

4.2.1 超声波振荡器。

4.2.2 高效液相色谱仪，带荧光检测器。

4.2.3 天平：感量为0.1mg。

4.2.4 pH 计：精度为0.01。

4.2.5 料理机。

4.2.6 恒温水浴锅。

4.2.7 0.45um微孔水相滤膜。

4.3 试样处理：

4.3.1取样品适量，磨成粉末，精密称取样品约1.0g（精确到0.0001g），置于200ml

棕色容量瓶中，加30ml二甲基亚砜，置于85℃恒温水浴锅中振摇溶解后，取出，待冷却至室温后,用水并释至刻度，摇匀，取滤液再经0.45um微孔水相滤膜过滤即得。

4.3.2 同法处理样品加标（添加适量标准物质或标准溶液）及试剂空白。

4.4色谱条件

色谱柱：C18反相色谱柱（粒径5μm，250mm ×4.6mm）或相当者。

流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液-甲醇=65+35。

流  速：0.70 ml/min。

检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm。

进样量：20μL。

4.5标准曲线绘制

将维生素B2标准系列工作依次按上述色谱条件上机测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，标准系列工作浓度为横坐标，绘制标准曲线。

4.6 试液测定

将试液按上述色谱条件进样测定，根据标准曲线得到待测液中维生素B2的浓度。

4.7结果计算

试样中维生素B2的含量计算：

 C×V×f

X =                ×100

       m×1000

式中：

X ——试样中维生素B2的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；

C ——由标准曲线计算得到的试样中维生素B2 的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；

V——试样定容体积，单位为毫升（ml）；

f ——试样稀释倍数；

m ——试样质量，单位为克（g）；

100 ———换算为100克样品中含量的换算系数；

1000———将浓度单位μg/mL换算为mg/mL的换算系数。

结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

 

 

5. 叶酸的测定

本方法修改采用GB 5413.16《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定》的方法。本方法与GB 5413.16相比，主要差异为修改了样液处理用试剂及样液稀释倍数。

5.1试剂和材料

1）菌株：鼠李糖乳杆菌 。

2）培养基：乳酸杆菌肉汤培养基，叶酸测定用培养基。

3）9g/L氯化钠溶液（生理盐水）：称取9.0g 氯化钠溶解于1000ml 水中，分装试管，每管10ml 。121℃灭菌15 min 。

4）氨水（0.5 % ）。

5) 磷酸盐缓冲液Ⅰ（0.05 mol/L ）：称取5.85g 磷酸二氢钾，1.22g 磷酸氢二钾，用1000ml 水溶解。临用前按0.5g/100ml 加入抗坏血酸，用4mol/L氢氧化钾溶液调PH至6.8±0.1。

6) 抗坏血酸。

7）氢氧化钾溶液（4 mol/L ）：称取224g 氢氧化钾于1000ml 烧杯中，用400ml 水

溶解，冷却至室温后，转移至1000ml 容量瓶中，用水定容。

8）叶酸标准贮备液（100μg/ml）：精密称取 11mg 标准品于100ml棕色容量瓶中，

加0.5%氨水20ml使溶解，计算贮备液的体积（ml）= m标准品称样量×10×c标准品纯度，

用水稀释溶液至刻度，用吸管加水至计算要求的体积，充分混合。

9）叶酸标准中间液（1μg/ml）：吸取1ml标准贮备液，用水定容至100ml。

10）叶酸标准工作液（10ng/ml）：吸取1ml标准中间液，用水定容至100ml。

11）叶酸标准曲线工作液（0.1ng/ml）：吸取1ml 标准工作液,用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至100ml。

5.2 仪器和设备

5.2.1 超声波振荡器

5.2.2 紫外分光光度计

5.2.3 天平：感量为0.1mg

5.2.4 pH 计：精度≤0.02

5.2.5 培养箱：36℃±1℃

5.3 样液的制备

5.3.1测试菌液的制备：将鼠李糖乳杆菌从日接种管接种至乳酸杆菌肉汤培养基，36±1℃培养过夜。在无菌条件下离心该培养液10min（2000转/分钟），弃去上清液。用10ml生理盐水振荡洗涤菌体，离心10min（2000转/分钟），弃去上清液（共两次）。吸适量该菌悬液于10ml生理盐水中，混匀制成测试菌液。以生理盐水做空白，用分光光度计，于550nm波长下，测得光密度值应在60～80%之间。

5.3.2试样处理

称取试样约1.1g（精确至0.0001g）于250ml容量瓶中，加0.5%氨水20ml使溶解，并稀释至刻度。取500μL 样液加19ml磷酸缓冲液Ⅰ于100℃水浴加热5min后，用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至250ml，得试样溶液。

5.3.3 同法处理样品加标（添加适量标准物质）及试剂空白。

5.3.4标准曲线管的制作：按下表顺序加入水、标准曲线工作液和叶酸测定用培养基于培养管中，一式三份。

试管号(编号)	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10
蒸馏水（ml）	5	5	4.5	4	3.5	3	2.5	2	1	0
标准工作液（ml）	0	0	0.5	1	1.5	2	2.5	3	4	5
叶酸测定用培养基（ml）	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

 

5.3.5试样管的制作：按下表顺序加入水、试样溶液和叶酸测定用培养基于培养管中，一式三份。

试管号(编号)	1	2	3	4
蒸馏水（ml）	4	3	2	1
试样溶液（ml）	1	2	3	4
叶酸测定用培养基（ml）	5	5	5	5

5.3.6 灭菌：将标准曲线管和试样管于121℃灭菌5 min，迅速冷却到室温。

5.3.7 接种：无菌条件下每管中均加入约50μl菌悬液。（标准曲线未接种空白管S1除外）。

5.3.8 培养测定：在36±1℃，培养16～24h，以S1为空白对照，在波长550nm下测定S10标准曲线管光密度值，重新培养2h再测，直至两次绝对差≤2%，取出全部检验管测其吸光度。

5.4 定量分析

5.4.1标准曲线绘制：以叶酸标准品含量为横坐标，吸光度平均值为纵坐标，绘

制标准曲线。

5.4.2试样管测定液中叶酸浓度的计算：根据试样管测得的吸光度（吸光度值超出标准曲线管S3～S10 范围的试样管要舍去），从标准曲线查得该测定液叶酸的含量并计算每亳升的浓度。计算每个编号测定液的叶酸浓度平均值，每支试管测得的浓度与该编号平均值的相对偏差应小于±15%，超过者要舍去，并如果符合该要求的管数少于所有四个编号试样管总管数的2/3， 需要重新检验。如果符合该要求的管数大于等于原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液叶酸浓度的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx，用于计算试样中的叶酸含量。

5.5 分析结果的表述

试样中叶酸的含量计算：

Cx×f×100

 X =                

       m×1000

式中：

X——试样中叶酸的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；

Cx——计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

f——稀释倍数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。

 

 

6.泛酸的测定

  本标准修改采用 GB 5413.17《婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定(第二法 高效液相色谱法)》的方法。本标准与 GB 5413.17的主要差异为修改了样品前处理步骤及色谱条件。

6.1试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。

1）甲醇(CH4O)：色谱纯。

2） 盐酸。

3） 硫酸锌(ZnSO4)。

4） 盐酸（2.0mol/L）：移取33.2ml 盐酸于200ml容量瓶中，用水定容。

5） 硫酸锌溶液（15 g/100ml）：称取15g 硫酸锌用水溶解并定容至100 ml。

6） 磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L）：称取6.8g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至

1000 ml。用磷酸调节pH至3.0，用0.45μm滤膜过滤。

7） 泛酸标准溶液 泛酸标准储备液（1mg/ml）：准确称取泛酸钙25.0mg，加水溶解并定容至25 ml。泛酸浓度=泛酸钙浓度×0.920

8） 泛酸标准中间液（0.1mg/ml）：吸取标准储备液10ml 于100ml容量瓶中，加水定容。临用前配制。

9） 泛酸标准系列测定液：准确吸取泛酸标准中间液1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml、10.0ml，至100ml容量瓶中用水定容。该标准系列浓度分别为1.0 ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml。临用前配制。

6.2 仪器和设备

6.2.1 高效液相色谱仪，带DAD检测器。

6.2.2 pH计：精度为0.01。

6.2.3 超声波振荡器。                      `

6.2.4 天平：感量为0.1mg。

6.3 样液的制备

6.3.1 取样品适量，磨成粉末，称取试样约1.0g（精确到0.0001g）加入约25ml 45℃～50℃的水于200ml烧杯中，振摇溶解后超声萃取20min，待试样溶液降至室温后，用盐酸溶液(0.1mol/L)调节试样溶液的pH值至4.5，加入10ml硫酸锌溶液，充分混合，转入100ml容量瓶，用水定容至刻度并充分混匀，滤过，供进样用。

6.3.2 同法处理样品加标（添加适量标准物质或标准溶液）及试剂空白。

6.4 色谱条件

色谱柱：ODS-C18（粒径5μm， 250mm×4.6mm ）。

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液、甲醇，梯度洗脱。

时间（min）	0.05mol/L磷酸二氢钾%A	甲醇%B
0	99	1
35	99	1
36	70	30
50	70	30
51	99	1
60	99	1

 

流速：1.0 ml/min。

检测波长：200nm。

柱温：30℃。

进样量：50uL。

6.5 标准曲线绘制

将泛酸标准系列工作液依次按上述色谱条件上机测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

6.6 试液测定

将试液按上述色谱条件进样测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。同法测定样品加标（添加适量标准物质）及试剂空白。

6.7 结果计算

试样中泛酸的含量计算：             

 C×V×f

X =                 ×100

       m×1000  

式中：

X ——试样中泛酸的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；

C ——试液的进样浓度，单位为微克每毫升（ug/ml）；

V ——试样定容体积，单位为毫升（ml）；

f ——试样稀释倍数；

m ——试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

【重量差异指标】

应符合《中华人民共和国药典》中“制剂通则”项下片剂的规定。                  

【原辅料质量要求】

1、碳酸钙：应符合GB 1886.214 《食品安全国家标准 食品添加剂 碳酸钙（包括轻质和重质碳酸钙）》的规定 
2、β-胡萝卜素：应符合卫生计生委2012年第6号公告的规定 
3、醋酸视黄酯：应符合GB 14750 《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素A》的规定 
4、维生素D3：应符合《中华人民共和国药典》中维生素D3的规定 
5、盐酸硫胺素：应符合GB 14751 《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素B1（盐酸硫胺）》的规定 
6、核黄素：应符合GB 14752 《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素B2（核黄素）》的规定 
7、盐酸吡哆醇：应符合GB 14753 《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素B6（盐酸吡哆醇）》的规定 
8、氰钴胺：应符合《中华人民共和国药典》中维生素B12的规定 
9、叶酸：应符合GB 15570 《食品安全国家标准 食品添加剂 叶酸》的规定 
10、L-抗坏血酸钠：应符合GB 1886.44 《食品安全国家标准 食品添加剂 抗坏血酸钠》的规定 
11、D-泛酸钙：应符合《中华人民共和国药典》中泛酸钙的规定 
12、D-α-醋酸生育酚：应符合GB1886.233 《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素E》的规定 
13、乳粉：应符合GB 19644 《食品安全国家标准 乳粉》的规定 
14、山梨糖醇：应符合GB 1886.187 《食品安全国家标准 食品添加剂 山梨糖醇和山梨糖醇液》的规定 
15、白砂糖：应符合GB/T 317 《白砂糖》的规定 
16、可可粉：应符合GB/T 20706 《可可粉》的规定 
17、羟丙基甲基纤维素：应符合GB 1886.109 《食品安全国家标准 食品添加剂 羟丙基甲基纤维素（HPMC）》的规定 
18、硬脂酸镁：应符合GB 1886.91 《食品安全国家标准 食品添加剂 硬脂酸镁》的规定 
19、聚乙烯醇：应符合GB 31630 《食品安全国家标准 食品添加剂 聚乙烯醇》的规定 
20、滑石粉：应符合GB 1886.246 《食品安全国家标准 食品添加剂 滑石粉》的规定 
21、吐温 80：应符合GB 25554 《食品安全国家标准 食品添加剂 聚氧乙烯（20）山梨醇酐单油酸酯（吐温 80）》的规定 
22、聚乙二醇：应符合《中华人民共和国药典》2015年版四部的规定 

【预混料】

表1.1、预混（颗粒由碳酸钙、白砂糖、乳粉、可可粉、山梨糖醇、羟丙基甲基纤维素预处理而成。）

表1.2、预混（辅料麦奶香精由麦芽糊精、阿拉伯胶、三乙酸甘油酯、麦芽酚、香兰素、丁二酮预处理而成。）

表1.3、预混（原料醋酸视黄酯由明胶、玉米淀粉、醋酸视黄酯、白砂糖、二丁基羟基甲苯预处理而成。）

表1.4、预混（原料氰钴胺由氰钴胺、麦芽糊精、柠檬酸钠、柠檬酸预处理而成。）

表1.5、预混（原料β-胡萝卜素由β-胡萝卜素（杜氏盐藻）、明胶、植物油（大豆油）、食糖、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E（混合生育酚浓缩物）、二氧化硅预处理而成。）

表1.6、预混（原料维生素D3由维生素D3、辛烯基琥珀酸淀粉钠、蔗糖、抗坏血酸钠、辛，癸酸甘油酯、二氧化硅、dl-α-生育酚预处理而成。）

表1.7、预混（原料D-α-醋酸生育酚由D-α-醋酸生育酚、二氧化硅预处理而成。）

表1.8、预混（预混料由β-胡萝卜素、醋酸视黄酯、维生素D3、盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、叶酸、L-抗坏血酸钠、D-泛酸钙和D-α-生育酚预处理而成。）

表1.9、预混（原料核黄素由核黄素、玉米淀粉、单,双甘油脂肪酸酯预处理而成。）

【包衣预混剂】

表3、包衣预混剂